用了条件性基因敲除小鼠就能发高分文章？首先你得跨过这些坑掉坑 100 次？这篇干货教你重新「做鼠

在学习跨坑之前，先来了解一下条件性基因敲除小鼠真身。

条件性基因敲除 CKO

条件性基因敲除（Conditional Knockout）是指将某个基因的修饰限制于小鼠某些特定类型的细胞或发育的某一特定阶段，实现对小鼠基因组的时空特异性修饰。

应用

胚胎致死性基因的研究

研究靶基因在特定组织或细胞中的功能

研究靶基因在特定时期或阶段发挥的作用

优势

多功能的基因敲除模型，可与不同工具鼠灵活搭配使用

明确了目的基因缺失的细胞类型或缺失发生的特定时间，更加客观而系统地研究目的基因在不同组织器官发生、发育或疾病发生、治疗过程中的作用与机制

克服了重要基因完全敲除后的胚胎致死或过早死亡，研究表明约有 1/3 的基因纯合敲除后会导致小鼠胚胎期死亡或出生期死亡

避免由于全身性敲除目的基因可能引发的其它基因的代偿，导致基因敲除后没有明显表型改变

为什么拥有条件性基因敲除小鼠模型更容易发高分文章？

一篇好文章，意味着我们需要一个好故事。时间、地点、人物，这故事的三大基本要素自然是缺一不可！

简单的来说，故事的主人公就是我们所研究的基因。而 CKO 除了可以明确目的基因的缺失在特定组织或细胞类型之中发生，还可以限制发生的特定时间。

与普通的 KO 相比，CKO 无疑提供了更精准确凿的不在场证明。这样的故事当然也就更有说服力，再也不怕 reviewer 质疑啦！

完美！

不过，

如果你看到这里就满心欢喜，小编只能说：

TOO YOUNG TOO SIMPLE!

条件性基因敲除美丽的背后可是暗藏玄机呢！

条件性基因敲除的这些坑，你踩过几个？

组织特异性 Cre 其实没那么特异？

我用的 GFAP-Cre 和你用的 GFAP-Cre 不一样？

原来 Cre 小鼠用雌鼠和用雄鼠还不一样？

我的 CKO 小鼠为什么基因还没被敲除？

Cre 小鼠也会不育？

广泛表达的 Cre 在所有组织表达不一样高？

诱导型 Cre 其实会漏？

下面就让小编来给你填土埋坑！

文末有彩蛋哦，可别等不及直接拉到最后看，错过前面的干货就可惜了～

组织特异性 Cre 真的那么特异吗？

师兄，应该是肝脏特异表达的 Cre，怎么好像在脑里也有表达？

唉，理想是丰满的，而现实往往是骨感的。其实，Cre 的非特异性表达是普遍存在的啊！大部分 Cre 品系在其它组织中也有 Cre 活性。

由于 Cre 的非特异性表达导致基因敲除的脱靶，有可能在你不自知的时候直接影响到你的实验数据。

比如，受神经元特异性 Emx1（empty spiracles homolog 1）启动子驱动的 Cre 小鼠，除了在新皮质和海马中高表达 Cre 以外，在肾脏和胸腺中也会表达 Cre。

图1. Emx1-Cre在大脑（A）、胸腺（B）、肾脏（C）的表达。（图片来自 jaxlab）

如果 Cre 的脱靶发生在生殖细胞里，那就有可能直接得到全身性敲除小鼠了。还是以 Emx1-Cre 为例，研究发现在一小部分生殖细胞中也有 Cre 表达，并且雄性与雌性都可能出现这样的脱靶。

那我怎么知道有没有发生生殖系脱靶呢？

我们可以通过 PCR 方法发现是否发生了全身敲除。只需要在 flox 区域的上下游分别设计一条上游引物和一条下游引物（下图橙色箭头）。

如果发生了全身敲除，那么在做基因型鉴定 PCR 时，会出现一条最短的条带。将带有这条短带的小鼠移除即可。

我用的 GFAP-Cre 和你用的 GFAP-Cre 不一样？

我和文献里用的明明都是 GFAP-Cre，为什么表型差别这么大？

看看你买的 GFAP-Cre 全名叫啥？从哪来的？不同机构构建的 Cre 品系，Cre 的表达谱都不一样！

虽然 Cre 都受 glial fibrillary acidic protein promoter 驱动，但 Tg(GFAP-cre)8 Gtm 主要在星形胶质细胞中表达 Cre；而 Tg(GFAP-cre)25Mes 除了在中枢神经系统中的星形胶质细胞、少突神经胶质、室管膜以及一些神经元中表达 Cre，还在心内膜、肺血管内皮细胞、肝脏门静脉周细胞、附睾管中有 Cre 表达。这差别可不是一点半点呢。

图 2. Cre recombinase expression in Gfap-cre mice occurs in the endocardium (p), pulmonary vascular endothelium (q), endothelial cells of the liver portal system (r), ductus epididymis (s), islets of Langerhan’s and pancreatic duct endothelium (arrowheads) (t), as well as endometrial and glandular endometrial cells of the uterus (arrowheads) (u).（图片来自 Nat Commun. 2012;3:1218.）

师兄，为什么会有这些差异呢？

这与 Cre 鼠的构建方式有很大的关系。目前用的比较多的 Cre 品系都还是以随机整合转基因的方式构建的。也就是将启动子连同 Cre cDNA 序列通过显微注射进入小鼠受精卵，在小鼠染色体中随机整合。

这样，整合位点是不可控的；拷贝数也不可控；重组酶基因容易被沉默或发生异位表达等。

另外，人源或大鼠启动子在小鼠体内的表达也可能存在差异，启动子长度及区域也会影响启动子特异性。

所以导致了最终 Cre 表达谱的诸多差异。

看来购买 Cre 工具鼠可得小心谨慎。

是啊，所以说前期的文献工作很重要呢！

通过已发表的文献，可以知道主要在哪些组织或细胞中表达 Cre。

如果找不到 Cre 的相关文献，那么保险起见，还是将 Cre 小鼠与报告基因工具鼠交配一下，看看子代双阳性小鼠里哪些组织有报告基因的表达，那么就可以大致判断这种 Cre 小鼠是否合适了。

那如果我买不到合适的 Cre 工具鼠怎么办？

如果没有现成适合的 Cre 小鼠的话，那么可以定制你的 Cre 工具鼠。

为了避免转基因品系的那些缺点，将 Cre 定点敲入（Knock in）到你指定的小鼠内源基因里，让 Cre 受内源基因天然启动子的调控，表达成功率更高而且也更稳定。

听说上海南方模式生物最近有一个工具鼠众筹项目，可以花小钱定制工具鼠。你可以留意哦，扫这个二维码就行。

太好了！谢谢师兄！对了，刚刚你那张表格是在哪里查到的？

是 MGI 的 Recombinase (cre) Activity 数据库哦。

http://www.informatics.jax.org/home/recombinase

可以按你想要查询的组织类型或特殊的启动子名称来查询相关的 Cre 工具鼠品系，很方便呢！

原来 Cre 小鼠用雌鼠和用雄鼠还不一样？

师兄，我应该用雄性 Cre 配雌性 flox 小鼠还是用雌性 Cre 配雄性 flox 小鼠呢？

这个问题要看你使用的是哪种 Cre 啦，有的 Cre 小鼠父性遗传与母性遗传的重组效率有所差别哦。

比如对于 EIIa-Cre 来说，来自母本的 Cre 在肾脏、肝脏、肠、胰腺中具有广泛均匀的 Cre 活性，但在脾脏中呈马赛克式的镶嵌表达；而来自父本的 Cre 则都表现为镶嵌式的重组活性。所以用雌性 Cre 来交配效率更高。

图 3. 亲本的来源对 Cre 在体内的表达谱的影响。EIIa-Cre 与 Rosa26-LSL-lacZ 交配获得子代，lacZ 染色结果：(a-c) Cre 来自母本；(d-f) Cre 来自父本。（图片来自 Nat Commun. 2012;3:1218.）

救命啊！我的 CKO 小鼠为什么基因还没被敲除？

师兄，我的 Cre 到底有没有起作用啊？为什么基因还在表达？

先别急，再做一次基因型鉴定试试。确定是 Flox 纯合子同时 Cre 阳性吗？

我已经 P 了 3 次了，错不了。

那你是怎么鉴定你要敲除的基因还在表达呢？

mRNA 水平都没有变化…

RealtimePCR 引物设计在哪？我记得你敲除的是基因的 exon6 吧，如果你的一对引物都设计在 exon6 之前，那么 exon1-5 还是有可能被转录出来，表达量上就可能看不出差异了。

哦，我明白了，那我重新设计引物试试。一条引物放在被敲除的 exon6 上。

如果真的没敲掉，说明你的 Cre 小鼠重组效率可能不容乐观啊。你也许要考虑找个全身性敲除的小鼠来交配一下，用 KO/Flox 杂合子同时 Cre 阳性的小鼠作为敲除组，这样 Cre 只需要在一个等位基因上起作用就可以了，敲除效率可能会提高一些。

另外，其实不同基因的 flox 有的容易被 Cre 重组，有的则比较困难。这可能是由于染色体的状态导致 Cre 酶比较难接近 loxp 位点的关系。

Cre 小鼠也会不育？

师兄，我用 flox 小鼠跟 Cre 小鼠交配了，但老是得不到实验组小鼠。我为了提高阳性小鼠的比例，还特意把 Cre 小鼠自交了呢。

你的 flox 基因和 Cre 不会是在同一条染色体上吧？

Flox 基因在 6 号染色体，Cre 我还真没注意。

Cre 如果是随机整合的，确实不好判断整合在什么地方。有可能插入到某个基因里破坏了这个基因的功能，如果是纯合子的话就可能有不育或者其它表型呢。

而且如果 Cre 活性过高可能引起在基因组中未知的 loxP 位点重组，从而引发敲除或异位，严重的会影响小鼠存活。

Cre 如果是 knockin 的，那从文献或资料中就能知道整合在哪条染色体上了。

一般 Cre 还是用杂合子小鼠比较稳妥。

广泛表达的 Cre 在所有组织表达都一样高？

为什么我用 CAG-CreER 小鼠在 Tamoxifen 诱导以后，有的组织敲除的好，有些组织不是那么理想呢？

你又真相了。哪怕是号称全身广泛表达的 Cre，在不同组织中还是会有所差异的。比如 CAG-CreER 在诱导后，在平滑肌、胰腺里表达要比在卵巢或脾脏中高。UBC-CreER 也有类似的情况。

诱导型 Cre 其实会漏？

为什么我还没给 Tamoxifen ，就已经能检测到 KO 条带了？

虽然理论上 Cre-ER 在没有 Tamoxifen 诱导时应该在细胞质内，而无法进入细胞核重组 loxp 位点。但实际上还有一些 Cre-ER 的小鼠即使在未诱导状态，仍会发生不同程度的 DNA 重组，比如：Tg(Ins2-cre/Esr1)1Dam、Tg(Tyr-cre/ERT2)13Bos 等。

天呐，原来 CKO 这么坑啊！

其实了解了，也就不用怕啦！

希望这篇文章对正在使用 Cre 工具鼠的你能有所帮助，不用走太多弯路！

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Reference

1. Gorski JA, Talley T, et al. Cortical excitatory neurons and glia, but not GABAergic neurons, are produced in the Emx1-expressing lineage. J Neurosci. 2002 Aug 1;22(15):6309-14.

2. Heffner CS, Herbert Pratt C, et al. Supporting conditional mouse mutagenesis with a comprehensive cre characterization resource. Nat Commun. 2012;3:1218.

3. Liu Y, Suckale J, et al. Tamoxifen-Independent Recombination in the RIP-CreER Mouse. PLoS One. 2010; 5(10): e13533.

4. Dankort D, Curley DP, et al. Braf(V600E) cooperates with Pten loss to induce metastatic melanoma. Nat Genet. 2009 May;41(5):544-52.

5. Vooijs M, Jonkers J, et al. A highly efficient ligand-regulated Cre recombinase mouse line shows that LoxP recombination is position dependent. EMBO Rep. 2001 Apr;2(4):292-7.

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文章来源：上海南方模式生物科技股份有限公司

题图来源：shutterstock.com 正版图库

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